近年来，基因编辑技术的飞速发展为生物医疗研究带来了革命性的变革。尤其是CRISPR-Cas13 RNA靶向系统在基础和应用科学领域的广泛应用，使其成为科学研究人员的重要工具。然而，在哺乳动物细胞和小鼠模型中，旁切效应的出现，以及在体内的靶向能力尚需提高、效率不稳定等问题，限制了其在生物体内的实际应用。在此背景下，我们很高兴分享2025年3月由西班牙安达卢西亚发育生物学中心等研究团队发表在《Nature Communications》上的最新研究成果。

本研究提出了一系列经过优化的策略工具，旨在通过瞬时方法提升斑马鱼中RNA靶向CRISPR-Cas技术的效率和精准性。这些优化方案为CRISPR-Cas技术在生物体内的应用开辟了全新的思路，提供了增强特异性与安全性的新方法，并为潜在的生物医学治疗奠定了基础。

研究背景显示，RfxCas13d源于黄化瘤胃球菌的Cas13d蛋白，作为一种新型的II类/VI型CRISPR-Cas RNA核酸内切酶，拥有巨大的生物医学潜力。最近，科学家们通过改进核糖核蛋白（RNP）复合物或mRNA-gRNA递送技术，实现了在斑马鱼和其他动物胚胎中有效的瞬时RNA靶向。然而，研究还揭示了影响CRISPR-RfxCas13d系统在体内应用的多个局限性，如晚期基因靶向效率低等。

本研究提出了五项互补的技术优化策略，包括化学修饰的gRNA（cm-gRNA）、核定位信号（NLS）组合、IVT gRNA毒性筛查、RNA靶向模型预测及替代系统等。这些策略不仅优化了斑马鱼胚胎中的RNA靶向技术，还有效解决了应用中遇到的一系列问题，例如体外转录gRNA毒性及靶向准确性等，提高了RNA靶向CRISPR-Cas系统的效率和适用性。

实验结果表明，使用化学修饰的gRNA与RfxCas13d的结合显著提高了基因功能缺失的表型可视化，尤其是在斑马鱼胚胎的发育后期。通过优化核定位信号，研究人员成功提升了核RNA的靶向和降解能力，验证了该技术的有效性。此外，基于体外计算模型的gRNA活性预测也显示了很高的准确度，进一步增强了RNA靶向研究的可行性。

总而言之，本研究通过多种优化策略显著提升了CRISPR-Cas13d在斑马鱼胚胎模型中的应用效率、安全性和特异性。研究结果揭示了在针对内源性RNA进行瞬时递送时的低附带活性，这对推动生物医疗研究以及未来的基因治疗具有重要意义。

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